Los científicos se " sorprenden " al descubrir que la herramienta de edición CRISPR no es tan precisa como se afirmaba anteriormente
Por Claire Robinson, 2 de abril de 2020
La herramienta de edición genética conocida como CRISPR-Cas12a o
Cpf1 ha sido considerada como una mejor opción que otras
herramientas de edición de Cas porque se creía que era más precisa
y menos propensa a hacer cortes fuera de objetivo en el ADN.
Pero un nuevo artículo muestra que el Cpf1 no realiza un corte tan
limpio o específico como se afirmaba. Los investigadores emplearon
ensayos in vitro usando una vasta colección de moléculas de ADN
sintetizadas que contenían variaciones en la secuencia del sitio de
edición. Encontraron que Cpf1 era muy propensa a hacer cortes de una
sola hebra, o "mellas", en las moléculas de ADN de doble
hebra. También se encontraron cortes de ADN de doble cadena fuera de
objetivo, aunque con una frecuencia menor que las incisiones de una
sola cadena.
Los hallazgos mostraron que la herramienta Cpf1 hizo cortes en
lugares de ADN que contenían hasta cuatro desajustes de unidades de
base de ADN en comparación con la secuencia del lugar objetivo
previsto. Eso significa que dañó un gran número de ubicaciones
claramente fuera de objetivo y claramente desajustadas.
Crucialmente, como los autores señalan, los programas de computación
generalmente usados para predecir los sitios de corte de ADN fuera de
objetivo de las herramientas de edición de CRISPR es poco probable
que recojan este tipo de actividad de corte de ADN Cpf1 no
intencional.
Los autores llegan a la conclusión de que "la detección de los
posibles efectos fuera de objetivo debido a un corte no específico
requeriría la secuenciación de todo el genoma o métodos de
detección especializados".
Las conclusiones, que los autores califican de "sorprendentes",
muestran que es necesario un examen más profundo, a nivel de todo el
genoma, de la actividad in vivo (en las células) de Cpf1 cuando se
utiliza para producir organismos editados genéticamente. Los
investigadores necesitan realizar ensayos in vivo con la herramienta
de edición de Cpf1 y múltiples ARN guía diferentes para comprobar
si lo que se ve en estos ensayos in vitro se traduce al entorno vivo
real de las células.
Esto es vital porque las inserciones o supresiones (indel) de ADN
pueden tener lugar en los sitios de ADN truncado. Esto puede dar
lugar a mutaciones no deseadas en todo el genoma de las células
seleccionadas, lo que podría conducir a cambios importantes en su
función.
Además, los investigadores necesitan volver a examinar los
organismos existentes editados con Cpf1 para comprobar estos efectos.
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CRISPR-Cas12a tiene efectos generalizados fuera de objetivo y de
la selección de ADN
Karthik Murugan, Arun S. Seetharam, Andrew J. Severin y Dipali G.
Sashital
Revista de Química Biológica
11 de marzo de 2020
doi: 10.1074/jbc.RA120.012933
Resumen
Cas12a (Cpf1) es una endonucleasa guiada por ARN en el sistema
inmunológico antifágico de tipo bacteriano V-A CRISPR-Cas que puede
ser reutilizada para la edición del genoma. Cas12a puede unirse y
cortar objetivos de dsADN con alta especificidad in vivo, lo que la
convierte en una candidata ideal para ampliar el arsenal de enzimas
utilizadas en la edición precisa del genoma. Sin embargo, esta alta
especificidad contradice el papel natural de Cas12a como un efector
inmunológico contra los fagos de rápida evolución. Aquí,
empleamos ensayos de escisión in vitro de alto rendimiento para
determinar y comparar las especificidades y actividades de escisión
nativas de tres ortólogos de Cas12a naturales diferentes (FnCas12a,
LbCas12a y AsCas12a). Sorprendentemente, observamos un corte
generalizado de secuencias específicas de bibliotecas de objetivos
aleatorios, con un fuerte corte de secuencias de ADN que contenían
hasta cuatro desajustes en las secuencias híbridas de ADN-ARN
dirigidas a Cas12a. También encontramos que estas actividades de
corte dependen del tipo y la posición de los desajustes y varían
con la ortología de Cas12a y la secuencia de ARN de CRISPR (ARNc).
Nuestro análisis reveló además un robusto corte inespecífico de
dsDNA cuando Cas12a es activado por la unión a un ADN objetivo.
Juntos, nuestros hallazgos revelan que Cas12a tiene múltiples
actividades de corte contra los sustratos de dsDNA y que estas
actividades varían entre los diferentes ortólogos de Cas12a.
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