Los científicos se " sorprenden " al descubrir que la herramienta de edición CRISPR no es tan precisa como se afirmaba anteriormente


Por Claire Robinson, 2 de abril de 2020


La herramienta de edición genética conocida como CRISPR-Cas12a o Cpf1 ha sido considerada como una mejor opción que otras herramientas de edición de Cas porque se creía que era más precisa y menos propensa a hacer cortes fuera de objetivo en el ADN.

Pero un nuevo artículo muestra que el Cpf1 no realiza un corte tan limpio o específico como se afirmaba. Los investigadores emplearon ensayos in vitro usando una vasta colección de moléculas de ADN sintetizadas que contenían variaciones en la secuencia del sitio de edición. Encontraron que Cpf1 era muy propensa a hacer cortes de una sola hebra, o "mellas", en las moléculas de ADN de doble hebra. También se encontraron cortes de ADN de doble cadena fuera de objetivo, aunque con una frecuencia menor que las incisiones de una sola cadena.

Los hallazgos mostraron que la herramienta Cpf1 hizo cortes en lugares de ADN que contenían hasta cuatro desajustes de unidades de base de ADN en comparación con la secuencia del lugar objetivo previsto. Eso significa que dañó un gran número de ubicaciones claramente fuera de objetivo y claramente desajustadas.

Crucialmente, como los autores señalan, los programas de computación generalmente usados para predecir los sitios de corte de ADN fuera de objetivo de las herramientas de edición de CRISPR es poco probable que recojan este tipo de actividad de corte de ADN Cpf1 no intencional.

Los autores llegan a la conclusión de que "la detección de los posibles efectos fuera de objetivo debido a un corte no específico requeriría la secuenciación de todo el genoma o métodos de detección especializados".

Las conclusiones, que los autores califican de "sorprendentes", muestran que es necesario un examen más profundo, a nivel de todo el genoma, de la actividad in vivo (en las células) de Cpf1 cuando se utiliza para producir organismos editados genéticamente. Los investigadores necesitan realizar ensayos in vivo con la herramienta de edición de Cpf1 y múltiples ARN guía diferentes para comprobar si lo que se ve en estos ensayos in vitro se traduce al entorno vivo real de las células.

Esto es vital porque las inserciones o supresiones (indel) de ADN pueden tener lugar en los sitios de ADN truncado. Esto puede dar lugar a mutaciones no deseadas en todo el genoma de las células seleccionadas, lo que podría conducir a cambios importantes en su función.

Además, los investigadores necesitan volver a examinar los organismos existentes editados con Cpf1 para comprobar estos efectos.

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CRISPR-Cas12a tiene efectos generalizados fuera de objetivo y de la selección de ADN
Karthik Murugan, Arun S. Seetharam, Andrew J. Severin y Dipali G. Sashital
Revista de Química Biológica
11 de marzo de 2020
doi: 10.1074/jbc.RA120.012933

Resumen
Cas12a (Cpf1) es una endonucleasa guiada por ARN en el sistema inmunológico antifágico de tipo bacteriano V-A CRISPR-Cas que puede ser reutilizada para la edición del genoma. Cas12a puede unirse y cortar objetivos de dsADN con alta especificidad in vivo, lo que la convierte en una candidata ideal para ampliar el arsenal de enzimas utilizadas en la edición precisa del genoma. Sin embargo, esta alta especificidad contradice el papel natural de Cas12a como un efector inmunológico contra los fagos de rápida evolución. Aquí, empleamos ensayos de escisión in vitro de alto rendimiento para determinar y comparar las especificidades y actividades de escisión nativas de tres ortólogos de Cas12a naturales diferentes (FnCas12a, LbCas12a y AsCas12a). Sorprendentemente, observamos un corte generalizado de secuencias específicas de bibliotecas de objetivos aleatorios, con un fuerte corte de secuencias de ADN que contenían hasta cuatro desajustes en las secuencias híbridas de ADN-ARN dirigidas a Cas12a. También encontramos que estas actividades de corte dependen del tipo y la posición de los desajustes y varían con la ortología de Cas12a y la secuencia de ARN de CRISPR (ARNc). Nuestro análisis reveló además un robusto corte inespecífico de dsDNA cuando Cas12a es activado por la unión a un ADN objetivo. Juntos, nuestros hallazgos revelan que Cas12a tiene múltiples actividades de corte contra los sustratos de dsDNA y que estas actividades varían entre los diferentes ortólogos de Cas12a.

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